La comprensione della struttura e della funzione delle proteine è fondamentale per la biologia molecolare e la medicina. Le modifiche a specifici amminoacidi, come la sostituzione di una cisteina, possono avere profonde implicazioni sulla conformazione tridimensionale di una proteina e, di conseguenza, sulla sua attività biologica. Questo articolo esplora le conseguenze di una tale sostituzione, con particolare attenzione alla cisteina in posizione 634, attingendo a dati di cristallografia proteica e a studi sul metabolismo dell'ossigeno.
Cristallografia neutronica e a raggi X: strumenti per l'analisi strutturale
I dati di diffrazione neutronica sui cristalli di una polisaccaride monoossigenasi litica di Neurospora crassa (NcLPMO9D) sono stati raccolti su IMAGINE presso l'HFIR a temperatura ambiente e su MaNDi presso l'SNS in condizioni crio-errate. Sono stati utilizzati cristalli della proteina idrogenata coltivata in tampone a base di H2O con volume superiore a 0,1 mm3. La raccolta dei dati sulla temperatura ambiente è stata eseguita sulla beamline IMAGINE. Un test del fascio bianco di quattro ore ha portato a una diffrazione ad alta risoluzione suggerendo che il cristallo era di dimensioni e qualità adeguate per un set di dati completo da raccogliere. Oltre a fornire informazioni preliminari sulla qualità di diffrazione del cristallo, l'esposizione iniziale del passaggio di banda larga può essere utilizzata per indicizzare il modello di diffrazione e determinare la matrice di orientamento del cristallo. Dato il gruppo spaziale P21 del cristallo, è stata implementata una strategia di raccolta dati di 18 fotogrammi con un tempo di raccolta di 20 ore per fotogramma. I dati sono stati raccolti in modalità quasi-Laue utilizzando un intervallo di lunghezze d'onda di 2,8 - 4,0 Å. Dopo la raccolta dei dati, i dati sono stati indicizzati, integrati scalati e uniti per fornire un file SLD di neutroni in formato MTZ ad una risoluzione di 2,14 Å. Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica a temperatura ambiente, lo stesso cristallo è stato utilizzato per raccogliere un set di dati di diffrazione a raggi X a temperatura ambiente con risoluzione 1,90 Å. I dati a raggi X sono stati utilizzati per determinare le posizioni degli atomi "più pesanti" tra cui C, N, O e S. La struttura raffinata rispetto ai soli dati a raggi X è stata quindi utilizzata come modello di partenza per eseguire un raffinamento congiunto rispetto ai dati a raggi X e neutroni.
Phenix ReadySet è stato utilizzato per aggiungere atomi H in siti non scambiabili, atomi H e D in siti scambiabili e atomi D alle molecole d del modello a raggi X di partenza. A seguito di questa preparazione del modello, sono stati eseguiti perfezionamenti iterativi su entrambi i set di dati. La costruzione di modelli interattivi è stata eseguita a Coot ispezionando visivamente le mappe di densità per orientare di conseguenza le catene laterali e le molecole d'acqua. I dati dei neutroni sono stati utilizzati principalmente per determinare gli stati di protonazione e gli orientamenti delle molecole d'acqua. Il confronto della mappa della densità elettronica di residui come serina e triptofano e la corrispondente mappa SLD neutronica illustrano le informazioni che possono essere ottenute sugli stati di protonazione nei siti scambiabili H/ D dalla diffrazione delle proteine neutroniche. Una sovrapposizione di mappe SLD di elettroni e neutroni per molecole d'acqua indica anche che mentre le interazioni dei legami idrogeno possono essere dedotte dai dati a raggi X, i neutroni forniscono informazioni chiare sull'orientamento di questi legami idrogeno.
Le mappe di omettire neutroni SLD FO-FC sono state generate per determinare gli stati di protonazione e l'orientamento H / D delle catene laterali. Sono illustrate le mappe SLD neutroniche ottenute per i residui di tirosina e treonina, in cui le mappe neutroniche Fo-FC indicano chiaramente picchi positivi che indicano la presenza di H/D. I dati di diffrazione neutronica raccolti hanno anche fornito preziose informazioni su più stati di protonazione, come il gruppo -ND3+ di Lys. Le statistiche di perfezionamento (Rwork e Rfree) sono state attentamente monitorate durante l'ottimizzazione del modello per evitare l'over-fitting.
I dati di criotemperatura sono stati raccolti su NcLPMO9D a seguito di un tampone di ascorbato per ridurre il sito attivo del rame da CuII a CuI sulla beamline MaNDi. I dati sono stati raccolti utilizzando la modalità TOF Laue a seguito di un test di diffrazione neutronica utilizzando un'esposizione di 4 ore per verificare la qualità della diffrazione. Dato il gruppo spaziale del cristallo, è stata ideata una strategia di raccolta dati di 18 fotogrammi con una dose di raccolta di 80 Coulomb per fotogramma. I dati sono stati raccolti in modalità TOF-Laue ad un intervallo di lunghezze d'onda di 2,0 - 4,0 Å. Dopo la raccolta dei dati, il set di dati di diffrazione di neutroni NcLPMO9D a criotemperatura di 2,40 Å è stato utilizzato per il perfezionamento dei dati solo neutroni. I dati dei neutroni sono stati messi in fase mediante sostituzione molecolare utilizzando PDB 5TKH come modello di partenza.
Phenix ReadySet è stato utilizzato per aggiungere atomi H in siti non scambiabili e atomi H / D con occupazioni parziali in siti scambiabili. Le molecole d'acqua sono state rimosse dal modello di partenza con gli strumenti PDB. La preparazione del modello è stata seguita dal perfezionamento con phenix.refine utilizzando la tabella di scattering neutronico. La costruzione di modelli interattivi è stata eseguita a Coot, con molecole d'acqua aggiunte utilizzando i picchi positivi della mappa FO-Fc e posizionate in base alle potenziali interazioni del legame idrogeno. Quando si analizzano le mappe SLD di neutroni, le molecole d'acqua sono chiaramente visibili se sono altamente ordinate, tuttavia la loro densità può essere sferica o ellissoidale se non sono ben ordinate.
Le mappe SLD neutroniche sono state utilizzate per fornire preziose informazioni sull'orientamento dei residui come l'asparagina, in cui la differenziazione tra i gruppi carbonile e amminico può essere difficile quando si utilizzano solo i dati di diffrazione a raggi X. I picchi nelle mappe di omissione SLD dei neutroni FO-FC sono stati anche molto istruttivi nel determinare gli stati di protonazione dei residui di istidina nella posizione N δ o N ε. Lo stato di protonazione dei residui con più siti scambiabili H/D può anche essere determinato utilizzando mappe SLD di neutroni. Ciò è stato chiaramente illustrato con una mappa di omissione SLD neutronica FO-FC di arginina, che è nota per avere una carica positiva. Come in precedenza, l'over-fitting è stato impedito monitorando Rwork e Rfree. Le statistiche finali hanno dato un Rwork del 22,58% e un Rfree del 30,84%.
Implicazioni della sostituzione di cisteina e del metabolismo dell'ossigeno
La cisteina è un amminoacido unico grazie al suo gruppo tiolico (-SH), che può formare legami disolfuro (-S-S-) con altre cisteine. Questi legami sono cruciali per la stabilizzazione della struttura terziaria e quaternaria di molte proteine. La sostituzione di una cisteina in una posizione specifica, come la 634, può alterare significativamente la stabilità e la conformazione della proteina. Se la cisteina in posizione 634 è coinvolta nella formazione di un legame disolfuro intramolecolare o intermolecolare, la sua sostituzione porterebbe alla perdita di questo legame, con conseguente cambiamento nella struttura tridimensionale della proteina e potenzialmente nella sua funzione.
Inoltre, la cisteina svolge un ruolo nel metabolismo dell'ossigeno. L'ossigeno molecolare (O2) è essenziale per la vita aerobica, ma la sua riduzione genera specie reattive dell'ossigeno (ROS), come il radicale superossido (O2•−), il perossido di idrogeno (H2O2) e il radicale idrossile (•OH). Questi ROS possono causare danni alle macromolecole cellulari, tra cui proteine, lipidi e acidi nucleici. I gruppi tiolici delle cisteine possono agire come antiossidanti, neutralizzando i ROS e proteggendo la cellula dallo stress ossidativo. La sostituzione di una cisteina, soprattutto se coinvolta nella difesa antiossidante, potrebbe compromettere la capacità della proteina di proteggere se stessa o altre molecole dai danni ossidativi.
Il gene RET (REarranged during Transfection) è un proto-oncogene che codifica per una proteina chinasi di superficie. Mutazioni in questo gene sono associate a diverse neoplasie. La sostituzione di una cisteina in una proteina come il recettore Ret può portare ad una dimerizzazione costitutiva e ad un'attivazione anomala del recettore, contribuendo allo sviluppo del cancro. Se una delle cisteine viene sostituita, quella spaiata può reagire con la cisteina di un altro recettore, portando ad una dimerizzazione perpetuata di due recettori Ret attivandoli costitutivamente.
La mutazione MTHFR è un difetto genetico che colpisce l'enzima metilen-tetraidrofolato reduttasi. Il difetto più comune è rappresentato dalla sostituzione di una citosina (C) in timina (T) al nucleotide in posizione 677 del gene della MTHFR (mutazione MTHFR C677T o 677C>T). Ciò corrisponde alla presenza di un'Alanina con una Valina nella catena amminoacidica della variante dell'enzima rispetto alla forma normale. Nei soggetti omozigoti per la mutazione MTHFR C677T, l'attività dell'enzima risulta ridotta del 50%. Un'altra mutazione associata ad una diminuita attività dell'MTHFR è la sostituzione di un'adenina (A) con una citosina (C) in posizione 1298 (variante genetica A1298C). In particolare, i soggetti portatori in omozigosi mantengono un'attività dell'enzima pari al 60%. La mutazione MTHFR viene analizzata in quanto è considerata un fattore di rischio per diverse patologie, soprattutto in presenza della concomitante carenza di acido folico o di vitamina B12 (cofattori dell'enzima metilen-tetraidrofolato reduttasi).
Come si trasmettono le malattie genetiche?
Le conseguenze della mutazione MTHFR sono varie e comprendono ritardi nello sviluppo psico-motorio, difetti del tubo neurale durante lo sviluppo fetale (es. La mutazione MTHFR è una delle cause in grado di determinare l'iperomocisteinemia (aumento del livello plasmatico di omocisteina). In presenza della mutazione MTHFR, l'omocisteina si può ritrovare anche nelle urine determinando una condizione nota come omocisteinuria. Alcune varianti della mutazione MTHFR (polimorfismi del gene) sono stati associati ad un aumentato rischio di comparsa di difetti a carico del tubo neurale. Il tubo neurale è una struttura presente nell'embrione, che si sviluppa dando origine al cervello ed al midollo spinale. L'ANENCEFALIA è uno dei disturbi più comuni che si manifesta in caso di mutazione MTHFR. Questa gravissima malformazione congenita è caratterizzata dal mancato sviluppo dell'encefalo e delle ossa del cranio. Un altro difetto del tubo neurale provocato da una mutazione MTHFR è la SPINA BIFIDA. Questa malformazione del sistema nervoso centrale, presente fin dalla nascita, è dovuta alla chiusura incompleta di una o più vertebre, durante lo sviluppo scheletrico. Da Sapere Per ridurre il rischio di difetti del tubo neurale, come la spina bifida, alle donne che programmano una gravidanza è consigliata l'integrazione alimentare di 0,4 mg/die di acido folico, a partire dal periodo pre-concezionale (almeno 1 mese prima del concepimento), da protrarre fino al terzo mese di gestazione.
Quando si analizzano le mappe SLD dei neutroni, diventerà evidente che la cancellazione della densità a causa della lunghezza di scattering neutronica negativa di H si verificherà per le proteine idrogenate che sono state sottoposte a scambio di vapore con tampone di cristallizzazione contenente D2O. Per questo motivo, le mappe SLD di neutroni in cui gli atomi H non scambiabili sono attaccati al carbonio appaiono incomplete rispetto alla loro controparte della mappa di densità elettronica. L'effetto della cancellazione è spesso più evidente a risoluzioni più scarse, rendendo imperativo ottenere cristalli proteici di alta qualità. È quindi preferibile eseguire un affinamento congiunto di un campione con dati sia a raggi X che a neutroni in cui i dati a raggi X possono essere utilizzati per determinare la posizione della spina dorsale proteica. Inoltre, gli atomi di zolfo nella cisteina e nella metionina possono essere scarsamente visibili, richiedendo dati a raggi X per il posizionamento esatto degli atomi. I metalli con lunghezze di scattering neutronica deboli possono anche essere difficili da modellare nelle mappe SLD di neutroni, come è evidente nelle nostre mappe LPMO9D.
La produzione di proteine per ottenere una struttura neutronica inizia con l'espressione batterica in mezzi a base di H2O o D2O per produrre un'alta resa di proteine ricombinanti idrogenate o perdeuterate, rispettivamente. La proteina viene purificata in un tampone a base di H2O e quindi cristallizzata in un tampone di cristallizzazione a base di H2O o D2O per far crescere i cristalli fino a una dimensione minima di 0,1 mm3. Prima della raccolta dei dati di diffrazione neutronica, i cristalli cresciuti con H2O subiscono lo scambio H / D per scambiare gli atomi H titolabili della proteina con lo scambio D. H / D può essere fatto immergendo direttamente i cristalli nel tampone di cristallizzazione deuterato, bilanciando la goccia di cristallizzazione con un serbatoio a base di D2O o montando i cristalli in capillari di quarzo per lo scambio di vapore con tampone di cristallizzazione deuterato.
Dopo lo scambio H/D, i potenziali cristalli vengono sottoposti a screening per determinare la qualità della diffrazione. I cristalli con una risoluzione minima di 2,5 Å sono considerati adatti per la raccolta di un set di dati completo. I cristalli sono montati in capillari di quarzo per la raccolta dei dati a temperatura ambiente o congelati in un crio-loop per la raccolta dei dati a temperatura criogenica. Un set di dati a raggi X viene raccolto sullo stesso cristallo (o su un identico) alla stessa temperatura. Il raffinamento viene eseguito utilizzando phenix.refine sia contro i dati di neutroni che di raggi X o solo contro i dati di neutroni. La costruzione manuale del modello della struttura proteica viene eseguita in Coot utilizzando le mappe SLD di neutroni. Dopo il completamento della struttura proteica, il modello di coordinate viene convalidato e depositato nella Protein Data Bank.
La sostituzione di una cisteina in posizione 634 può quindi alterare la stabilità strutturale, la capacità di legare ligandi, l'attività enzimatica o la capacità di interagire con altre molecole. Per comprendere appieno le implicazioni di tale sostituzione, sono necessarie analisi strutturali dettagliate, come quelle ottenute tramite diffrazione di raggi X e neutroni, combinate con studi funzionali in vitro e in vivo.