La preparazione di una soluzione standard di albumina di siero bovino (BSA) è un passaggio cruciale per la quantificazione delle proteine tramite il saggio BCA (Bicinchoninic Acid). Questo metodo consente di determinare la concentrazione di proteine in un campione.
Materiali necessari
- Albumina di siero bovino (BSA)
- Acqua distillata
- Tampone di lavoro BCA (preparato mescolando 50 parti di reagente A BCA con 1 parte di reagente B BCA)
- Micropiastra a 96 pozzetti
- Micropipette
- Lettore di micropiastre
Preparazione della soluzione stock di BSA
Per iniziare, è necessario preparare una soluzione stock di BSA a concentrazione nota. Dissolvere 10 mg di BSA in 10 mL di acqua distillata per creare una soluzione stock di 1 mg/mL. Durante la dissoluzione della BSA, è importante evitare di agitare eccessivamente per prevenire la formazione di schiuma.
Preparazione delle soluzioni standard di BSA
Dalla soluzione stock di 1 mg/mL, è possibile preparare una serie di soluzioni standard di BSA con concentrazioni comprese tra 0 e 2 mg/mL. Utilizzare acqua distillata per effettuare le diluizioni necessarie per questi standard. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/mL, si dovrebbe partire da una concentrazione di circa 1,5 mg/mL. Non è importante il valore assoluto della concentrazione quanto avere una concentrazione nota.
Un metodo alternativo per la quantificazione della BSA è quello di sciogliere 5 mg di BSA in 10 mL di dH2O e leggere allo spettrofotometro a 280 e 260 nm in una cuvetta di quarzo. La concentrazione di BSA può essere calcolata utilizzando la formula: [BSA](mg/mL) = (A280 X 1.55) - (A260 X 0.76). Partendo da una soluzione di BSA 0.5 mg/mL, la concentrazione dovrebbe essere circa 0.324 mg/mL.
Preparazione del reagente di lavoro BCA
Il reagente di lavoro BCA si prepara mescolando 50 parti di reagente A BCA con 1 parte di reagente B BCA. Assicurarsi una miscelazione accurata e lasciare incubare il reagente a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
Impostazione del saggio
Pipettare 10 μL di ciascuna soluzione standard di BSA e dei campioni proteici in pozzetti separati di una micropiastra a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 200 μL del reagente di lavoro BCA preparato a ciascun pozzetto.
Miscelazione e incubazione
Mescolare il contenuto di ciascun pozzetto pipettando o agitando delicatamente la piastra. Incubare la piastra a 37°C per 30 minuti.
Raffreddamento e misurazione
Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Per ottenere i migliori risultati, misurare l'assorbanza entro 30 minuti dall'arresto della reazione.
Analisi dei risultati
Tracciare una curva standard utilizzando i valori di assorbanza degli standard di BSA. La quantificazione BCA non è una quantificazione assoluta e il risultato misurato varierà a seconda del tecnico e dell'agente sperimentale. Per esperimenti diversi, dovrebbe essere utilizzato uno standard di campionamento a concentrazione fissa.
Come determinare la concentrazione proteica con il test proteico BCA
